小孢子

在孢子分大小两形时其小形者称为小孢子，是不等分裂的产物。

在蕨类植物，小孢子囊中产生32个或64个小孢子，可萌发形成极度退化的由几个细胞构成的雄性原叶体。水生蕨类的槐叶萍（Salvinia natans）、满江红（Azol-la imbricata）的小孢子，在小孢子囊内萌发时，可产生由四个营养细胞、两个精子器构成的雄性原叶体，由于生长的压力，孢子壁破裂而一部分裸露出来。

另外被子植物和裸子植物花药内的各花粉四分体也称为小孢子，它们将来发育成与雄性原叶体相同的花粉粒，因此认为它是相当于蕨类植物的小孢子。

选蕾

一般选择在天气晴朗的正午8：00-10：00之间取材，尽量选取主花序或生长状态较好的花序，然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾备用。

注释：

①、 如果遇到阴雨天气，为了不影响实验进程也可以取材，但一定要选取生长良好的花序，因为有研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。

②、甘蓝型油菜花序一般选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾，但是不同的油菜品种花蕾的发育时期不尽相同，可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定恰当发育时期（最佳时期为单核晚期至二核期）。

③、取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取过程的话，应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。

消毒

选取的花蕾用75%的酒精消毒1min（一般不要超过一分钟），然后用升汞消毒8-10min, 最后用无菌水清洗3次，每次5 min。

抽提花粉

①、将花蕾放置于玻璃管中，加入1-2滴B5液体培养液，用玻璃棒研磨使花粉散出，倒入过滤器过滤，花粉滤液盛入10ml离心管。

②、用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉，冲2-3次后，在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释。

③、将花粉悬浮液离心，800转/min，离心5min。

④、将离心管中的上层清液吸去，再加液体B5抽提液，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心（用封口膜封口），800转/min，离心5min，吸去上层清液。

加倍培养

①、将沉淀的花粉用NLN-16 液体培养基稀释（注：稀释不要超过10ml, 因为加倍完以后还要在10ml的离心管中再次稀释离心），倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2天左右（48h -72h之间）。

②、然后检查是否有污染的现象，如果没有污染，则分皿继续培养。

胚诱导培养

①、将加倍后没有污染的NLN-16花粉悬浮液再次倒入离心管中离心，600转/min，离心5min，倒掉NLN-16液体，留下沉淀的花粉。

②、将沉淀的花粉再次用NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿，一般每皿加入悬浮液3ml\\左右，每ml含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封口。

③、将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养，大概10天左右开始查看是否有可见的颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至50rpm、25℃恒温摇床上继续进行暗培养。

④、当暗培养的胚发育至子叶形胚形成时移入B5固体培养基，于20℃，16 hr光/8 hr暗，2000LUX光强条件下培养。

①、将暗培养获得子叶形胚移入B5固体培养基，于20℃，16 hr光/8 hr暗，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导。

②、进行再生苗诱导培养的胚一般15天左右换一次培养基进行继代培养，具体的时间依据胚在培养基的中生长状态决定，继代1-2次直至长出再生植株。

③、长出的再生植株继续在B5固体培养基上培养，依据生长状态定期进行继代。

④、移栽阶段：获得的再生苗一般在10月中旬开始移栽到大田，移栽时先要洗尽根部的培养基，移栽后立刻浇足定根水，用遮阳网覆盖，一般白天覆盖，晚上打开，直至移栽的再生苗成活，然后按照一般的大田管理进行管理。